השפעת חומצות אמיניות כחומר מזהם אורגני על גידול חיידקים אינדיקטוריים לפני ואחרי הכלרה

תקנים ישראליים ובין לאומיים קובעים איכות מים מבחינה מיקרוביאלית על סמך נוכחות חיידקים אינדיקטוריים לזיהום, וספירה כללית. עם העלייה בדרישות מחמירות יותר לאיכות מי שתייה ובעיית גידול מחדש, חיידקי קוליפורם נעשו פרמטרים בעלי חשיבות רבה יותר.

כבר ב-1930 פורסם מאמר שהצביע על אפשרות של גידול חוזר של חיידקים במי הספקה. משך זמן רב נראה היה שלא ניתן למצוא קשר מוחלט בין העובדה שברשתות הספקת המים השונות מוצאים תופעת הגידול מחדש לבין ריכוזים של חומר אורגני שנחשבו עד אז לחסרי חשיבות.

במשך השנים התברר כי לריכוזים נמוכים של חומר אורגני יש משמעות ביכולתם לשמש מזון לחיידקים שונים, ובמקרים מסוימים לחיידקים אינדיקטוריים לזיהום וגם לחיידקים פתוגניים. ניתן להעריך שבנוסף לאיכות תברואית ישירה, הרי חיידקים מתרבים במים יכולים להשפיע על טעם, ריח וצבע במים שיחרגו מגבולות התקן.

הסיבות האפשריות להתרחשות גידול מחדש הן: החלפה והתאוששות של חיידקים שהצליחו לחזור למצבם הקודם לאחר שהמים עברו טיפול בכלור וניזוקו, לאחר מכן מצליחים להתרבות, או כתוצאה מזיהום מיקרוביאלי מאוחר יותר של מערכת ההובלה על-ידי חיידקים שמקורם בשטח הפנים של פנים הצנרת (ריריות) או ממקורות חיצוניים למערכת ההובלה.

חיידקים שנפגעו בהכלרה ונשארו זמן מסוים לאחר מכן במערכת ההובלה ולא מתו, לא תמיד ניתנים לזיהוי בשיטה סטנדרטית לגידול הקוליפורמים, בתנאים מסוימים יכולים לעבור החלמה על מצעים מתאימים ולגדול, החלמה יכולה להתרחש גם בתוך מערכת ההובלה. כך יכולה התופעה להתרחש גם כאשר דגימות מים היוצאות ממתקן טיפול מים כשהן בעלות איכות מיקרוביאלית העונה על הדרישות.

ככל שמקורות המים מנוצלים למטרות נוספות מאשר למטרות שתייה, וככל שתרומות קולחין באיכויות שונות מגיעים אל נהרות, או מחלחלים למי תהום, הטיפול במים הכולל חיטוי, כך מתרבים ריכוזי חומרים לא רצויים במים. גידול משמעותי בדרך כלל מתרחש כאשר יש מספיק חומר זמין הניתן לניצול על-ידי מיקרואורגניזמים. לפיכך, מידע על ריכוז, מבנה של הנוטריאנטים במים המובילים, חשוב ביותר מבחינת בקרה על יכולת הגידול של חיידקים בתוך המערכת. בנוסף צנרת ההולכה עלולה להתעטף בשכבות ריריות המכילות חיידקים, פליטה אקראית של חלקיקים כאלה המכילים גם בנוסף חומרי תוצרת פעילות המיקרואורגניזמים, גם הם חשובים כגורמים פוטנציאליים לזיהום המערכת.

מזה כעשרים שנה עוסקות כמה קבוצות מחקר בניסיון להעריך את יכולת החיידקים למיניהם כולל חיידקים אינדיקטוריים ופתוגניים לגדול מחדש במים.

קיימות כמה שיטות להערכת אפשרות הגידול מחדש של חיידקים במים, חלקן מתבססות על ספירה ישירה של חיידקים. AOC שיטה אשר נמצאה ראויה להמלצה בספר הסטנדרט לבדיקות מים של ארה"ב (4). MGR קביעת מכסימום מהירות הגידול - שפותחה בגרמניה. וכן שיטות קביעת ריכוז הנוטריאנטים הנמצאים במים באופן כימי ישיר כגון ATP או Biodegradable dissolved organic carbon (ר"ת BDOC) - קביעת הפרש בריכוז חומר אורגני מומס במים לאחר פעילות החיידקים שפותחה בבלגיה וספרד.

כידוע חיידקים יכולים לגדול במים כאשר יעמדו לרשותם חומרי מזון, pH מתאים וטמפרטורה. מקובל להניח שהמים מכילים חומר אורגני נמדד, תרכובות פחמן, שחלקן זמין למיקרואורגניזמים, וחלבונים למיניהם. ניתן להעריך אם כך שהחנקן הזמין לחיידקים יכול לבוא מאמוניה, נטרטים ובמקרים מסוימים ניטריטים. נמצא שבתקופות הפריחה של אצות ריכוז חלבונים במי האגמים עולה. פפטידים קצרים נפוצים פי 4-5 מאשר חומצות אמינו בודדות, הם מהווים חלק מהפרקציה של חומצות הומיות. באופן כללי, ריכוז חומצות אמינו במים טבעיים עולה עם עלייה בריכוז DOC. חומצות אמיניות נמצאות במים בכל שלבי הטיפול במכונים ללא טיפול ביולוגי, ריכוזם יכול לעלות או לרדת בשלבים שונים. הן יכולות לגרום לדרישת כלור מוגברת ולגרום להיווצרות חומרים שיכולים להיות מזיקים (3).

חיטוי מים, מקובל ביותר, נעשה תוך שימוש בכלור. מכאן ניתן להניח הנחה סבירה שחלק מהכלור נקשר לחלבונים, שבקצותיהם נמצאות חומצות אמינו ונוצר קשר כלור חומצה אמינית.

דרישת כלור על-ידי חומצות אמינו חופשיות תלוי במבנה שלהן. ניתן לתאר מנגנון קלאסי של התגובה עם חומצה אמינית כדלקמן: בהתחלה כלור מגיב עם קבוצה אמינית ראשונית. בשלב זה של הכלרת חומצות אמינו חופשיות נצרכים 2 מול כלור על כל מול של חומצה אמינית (2). נוצרים מונו-ודיכלוראמינים אורגניים כתלות במנת כלור. בהמשך נוצרים אלדהידים וניטרילים ספציפיים אשר יכולים להיות אחראים על היווצרות ריח וטעם במים. כמו כן נמצא שצריכת כלור על-ידי חומצות אמינו בודדות משתנה מ-2.5 עד 16 מול/מול Cl₂. נמצא כי דרישת כלור על-ידי פוליפפטידים עולה עם עלייה במשקל המולקולרי של השרשרת. בגליצין צריכת כלור היתה גדולה יחסית, 5.5-5.7 מול/מול Cl₂, כפי שנמצא על-ידי מעבדות שונות. עובדה זו ניתן להסביר על-ידי תהליך חימצון מלא של תוצרים עד לשחרור חנקן גזי ופחמן דו חמצני. בהתבסס על מנגנון התגובה הכימית, גליצין וחומצה אספרטית לא יכולים להגיב עם כלור כאשר הם נמצאים בתוך שרשרת פוליפפטידית.

מתוצאות שהתקבלו בניסויים עם הכלרה של 16 חומצות אמינו חופשיות, מספר אמינו סוכרים ופפטידים, ניתן היה לקבל נקודות שבר בעקומות צריכת כלור על-ידי חומצות אמינו חופשיות לחומצות הבאות: גליצין, אלנין, איזוליצין, ליצין, פנילאלנין, וולין. חומצות אמינו שמכילות קבוצות הידרוקסיליות, כגון סרין וטירוזין, הראו עקומות עם מספר נקודות מינימום ומקסימום. רוב החומצות האמיניות נותנות ריח לאחר ההכלרה. עוצמת הריח תלויה בזמן המגע עם הכלור וביחס המולרי של הכלור לחומצה האמינית (1). יש לציין עם זאת כי בספרות לא נמצאה התייחסות לנושא גידול מחדש של חיידקים על חומצות אמינו מוכלרות.

מטרת המחקר היתה לבדוק את תרומת החומצות האמיניות כמודל לחומר מזהם אורגני על חיידקים אינדיקטוריים, לפני ואחרי הכלרה.

בתחילה נבדק מרק נוטריאנט המורכב מתערובת של חומרים אורגניים שונים כגון חלבונים, פפטידים וחומצות אמינו חופשיות. בריכוזים נמוכים ביותר עדיין שימש כחומר גידול נוח לחיידקים, אולם כאשר המים הכילו מרק נוטריאנט מהול שעבר הכלרה, התברר שחיידק E. coli B גדל טוב יותר מאשר על אותו הריכוז ללא הכלרה.

אפשר להניח שכלור כמחמצן תוקף חלבונים ועושה אותם זמינים יותר לחיידקים. תופעה שנצפתה מספר פעמים לפני כן. נעשתה השוואה בין יכולת גידול של E. coli B ו-Pseudomonas fluorescens P17 על מספר חומצות אמינו בודדות: טריפטופן, פנילאלנין ו-ולין בריכוזים 100 מ"ג/ל ו-50 מ"ג/ל. התוצאות אשר התקבלו הצביעו על כך ש-E. coli B לא היה מסוגל לגדול על מקור פחמן יחיד כזה, ולעומתו Pseudomonas fluorescens P17 מצליח לעשות זאת, כאשר התוצאות בריכוז 50 מ"ג/ל חומצה אמינית היו זהות באופן כללי לתוצאות שהתקבלו עם ריכוז 100 מ"ג/ל.

כאשר חיידק Pseudomonas fluorescens P17 גדל על טריפטופן, נדרש פרק זמן של ארבעה ימים עד שמתחילה צמיחה, לעומת זאת על פנילאלנין נדרש פרק זמן קצר יותר. התוצאות שהתקבלו בגידול של שני החיידקים על וולין מצביעות על כך ששני החיידקים לא היו מסוגלים לנצל חומצה אמינית זו כמקור פחמן יחיד.

העובדה שחיידק E. coli B לא מסוגל לנצל חומצות אמינו בודדות אשר נבדקו כמקור פחמן יחיד היא מוזרה ואולי מצביעה על כך שכאשר חיידק מתרבה במים עומד לרשותו גם חומר אורגני פחמני זמין, אך ייתכן מחסור באנזימים שמכניסים חומצות אמינו לתוך התא, או אנזימים ספציפיים אחרים הקשורים לפירוק. ניתן להדגיש גם שלא היה לחיידק פחמן ראשוני אשר יכול היה לספק את האנרגיה הראשונית הדרושה לפירוק החומצה האמינית.

בנוסף נעשתה השוואה בין יכולת גידול של חיידק Pseudomonas fluorescens P17 על מקורות אנרגיה שונים. נבחרו שש חומצות אמינו, כל אחת בארבעה מצבים שונים:

1. חומצה אמינית כמקור פחמן יחיד.
2. חומצה אמינית ותוספת אצטט בריכוז 5 מ"ג/ל כמקור אספקת האנרגיה.
3. חומצה אמינית לאחר הכלרה כמקור פחמן יחיד.
4. חומצה אמינית לאחר הכלרה ותוספת אצטט בריכוז 5 מ"ג/ל כמקור אנרגיה.

התוצאות שהתקבלו מוצגות באיור 1 המצביע שהתקבלו תוצאות שונות בהשוואת יכולת גידול החיידקים על חומצות אמינו כמקור אנרגיה יחיד לבין חומצות אלו בתוספת אצטט כמקור פחמן הדרוש לחיידקים.

גידולו של Pseudomonas fluorescens P17 על חומצות אמינו מוכלרות

ניתן למיין את התוצאות לשלוש קבוצות:

• א. החיידק מצליח לגדול על טריפטופן, מתיונין ללא הכלרה רק כאשר יש תוספת אצטט. גם בטריפטופן ומתיונין מוכלרים לא הצליח החיידק לגדול באופן משמעותי, אך תוספת אצטט לחומצה האמינית המוכלרת הביאה לגידול קטן יותר מאשר נצפה בגידול על חומצה לא מוכלרת. זאת אומרת שעיקר מקור האנרגיה לגידול בא מתוספת האצטט.
  
• ב. החיידק גדל טוב מאוד על פנילאלנין גם ללא שום תוספת (עובדה זאת נצפתה גם לפני כן) אולם התברר שתוספת אצטט לא הביאה לעלייה במספר החיידקים. יש לציין כי בזמן ההכלרה של פנילאלנין התקבל ריח פרחים חזק. עובדה זו תואמת ממצאים של אחרים וייתכן שיש לכך קשר (1).
  כאשר פנילאלנין לאחר הכלרה שימש כמקור יחיד לגידול Pseudomonas fluorescens P17 לא התקבל כל גידול משמעותי גם לא בניסויים בהם הוכנס גם אצטט. יש לראות בכך שינוי בהרכב החומצה האמינית שהפכה להיות לא זמינה לחיידק.
  
  
• ג. ליזין, וולין וחומצה אספרטית לא הביאו לגידול החיידקים, לא כמקור פחמן יחיד ולא בתוספת אצטט.
  
  

יש לציין כי בגידול על ליזין, וולין וחומצה אספרטית מצליח החיידק במידה מסוימת לגדול גם לאחר ההכלרה. אך כאשר יש תוספת אצטט הוא מצליח להתרבות בשלושה סדרי גודל.

התוצאות שהתקבלו מראות על כך שהשפעת ההכלרה מתבטאת בזה שאותה תוספת אצטט היא הרבה יותר יעילה ומביאה לגידול טוב יותר על חומצות אמינו מוכלרות מאשר על אותן חומצות אמינו לא מוכלרות.

מהניסויים השונים שנעשו התברר שלעתים קרובות חומצה אמינית בלבד לא יכולה לשמש כמקור חנקן ופחמן יחיד, ויש להוסיף מקור פחמן כגון אצטט על מנת לקבל גידול של החיידקים. דבר זה מתבטא טוב יותר כאשר חומצה אמינית עוברת הכלרה.

מאחר ובמי הספקה יש חומר אורגני, חשוב מאוד שריכוז החומר הפחמני במים יהיה נמוך ככל שניתן. על כן לבדיקות ריכוז AOC ו-BDOC יש חשיבות גדולה ביותר בהערכת פוטנציאל גידול חוזר במים.