בקטריוצינים של חיידקי חומצת חלב - מאפיינים ומנגנוני פעולה

הבקטריוצינים הם פוליפפטידים המיוצרים ע"י אוכלוסיות של חיידקים גראם-חיוביים ושליליים, הניחנים בד"כ בפעילות בקטריצידית (bacteriocidal) כנגד אוכלוסיות חידקים ממינים קרובים [3-1]. הבקטריוצינים מהווים תוצר ישיר של תרגום רנ"א שליח ולפיכך, נבדלים מאנטיביוטיקה המהווים תוצר מובהק של מסלולי ביוסינתזה מורכבים יותר, לפי ההגדרה המסורתית של Tagg וחב' [3], הגנים המעורבים בביוסינתזה של הבקטריוצינים המיוצרים ע"י חידקים גראם-חיוביים ובחסינות העצמית (self-immunity) מצויים בפלסמידים אולם, לאחרונה, בד בבד עם התרחבות המחקר בנושא הבקטריוצינים התברר, כי גנים המעורכים בביוסיבתזה של הבקטריוצינים מצויים גם בכרומוזום החידקי [4].

מבין הבקטריוצינים השונים, אלה המיוצרים ע"י זנים של חיידקי חומצת החלב, מהווים בעשור האחרון כר נרחב למחקר [6-4], בעיקר תודות להיותם חלק מהחיידקים היצרנים תרביות מחמצת (starter culture) בייצור מזון מעובד הכולל שלב של תסיסה לקטית [7, 8]. התוצרים המותססים ניחנים כתכונות הבאות: א' - עמידות גבוהה יחסית כנגד זיהומים חיידקיים העלולים לפגוע באיכות המזון ו-ב' - עמידות גבוהה יחסית כנגד זיהומים חיידקיים בעלי פוטנציאל לגרימת הרעלות מוון [9]. העלייה בעמידות נגד קילקולים חיידקיים מיוחסת בעיקר להיווצרותם של חומצות אורגאניות, המלווה בירידת pH במהלך תהליך התסיסה [9].

אולם, בשנים האחרונות מתברר יותר ויותר, כי לבקטריוצינים המיוצרים ומופרשים ע"י חיידקים אלה עשוי להיות תפקיד בהקניית חלק מהעמידות המוגברת כנגד גורמים א' ו-ב' שהוזכרו לעיל [5, 6, 9]. העובדה, שבקטריוצינים אלה מיוצרים ע"י חיידקים המותרים לשימוש במזון (food grade), רגישותם של הבקטריוצינים לפירוק אנזימי ע"י פרוטאזות הפועלות במערכת העיכול האנושית וצריכתם הלכה למעשה ע"י האדם, הופכת אותם לחומרים בעלי פוטנציאל לשימוש כחומרי שימור טבעיים (biopreservatives). אכן, פוטנציאל זה בא לידי ביטוי בהיתרי השימוש, להם זכה הבקטריוצין nisin, המיוצר ע"י זנים Lactobacillus lactis [9, 10].

בשנת 1988 התיר המינהל למזון ותרופות (FDA) את הוספת nisin לתוצרי מזון מסוימים כדוגמת גבינות מותכות (processed cheese) למניעת נביטת נבגים של Clostridium botulinum ויצירת רעלן הבוטולינום [11]. על אף טווח הפעילות הניכר של הבקטריוצין nisin, בעיות טכנולוגיות אינן מאפשרות את יישומו, אלא רק במיגוון צר באופן יחסי על תוצרים. לפיכך, קיים עניין רב במציאת זנים נוספים של חיידקי חומצת חלב הניתנים להוספה למזון, ניחנים ביכולת לייצר ולהפריש בקטריוצינים ובעיקר בעלי יכולת יישום במיגוון רחב יותר של תוצרים. עיקר ההתעניינות מתרכז סביב בקטריוצינים חדשים הניחנים בטווח פעילות נרחב כולל חיידקים פתוגניים לאדם, כדוגמת זנים של Staphylococcus aureus, מינים שונים של Clostridium ובמיוחד זנים של Listeria monocytogenes. האחרון הוא פתוגן בעל חשיבות רבה נוכח כושרהתפתחותו בתנאי קירור ומעורבותו בהרעלות מזון, שהסתיימו בשיעורי תמותה של כ-30% [12, 48].

אוכלוסיות חיידקי חומצת חלב, הניחנות ביכולת לייצר בקטריוצינים, בודדו ממיגוון רחב של מקורות, ביניהם חומר צימחי, חלב, ריקמת שריר שלי בעלי חיים לאחר שחיטה, תוצרי מזון מעובדים, מעיים של בעלי חיים ואדם ובצואה של בעלי-חיים [6]. מרבית הבקטריוצינים המיוצרים ע"י חיידקי חומצת חלב מאופיינים בטווח פעילות צר, הכולל בד"כ חיידקי חומצת חלב, אך קיימים גם בקטריוצינים החורגים מעבר לטווח פעילות צר זה. ללא ספק, הבולט מבין הבקטריוצינים המיוצרים ע"י חיידקי חומצת חלב מבחינת טווח פעולתו הוא nisin. בקטריוצין זה ניחן בטווח פעילות בקטריצידית רחב ביותר, הכרלל אוכלוסיית של חיידקי חומצת חלב, מינים של חידקים פתוגניים יוצרי נבגים כדוגמת: C. perfringens, C. sporogenes, C. botulinum, מינים של הסוג Bacillus (B. macerans, B. cereus, B. stearmophilus) וחיידקים פתוגניים נוספים כולל זנים של S. aureus ו-L. monocytogenes [13].

מבנה ותכונות של בקטריוצינים המיוצרים ע"י חידקי חומצת חלב

הבקטריוצינים המיוצרים ע"י חיידקי חומצת חלב מהווים קבוצה הטרוגנית של חלבונים ופפטידים, הן מבחינת המיבנה המולקולתי והן מבחינת תכונותיהם הביופיזיקליות. על פי מיבנם הכימי, ניתן לסווג את הבקטריוצינים המיוצרים ע"י חיידקי חומצת חלב לשתי קבוצות. הקבוצה הראשונה קטנה מאוד בהיקפה וכוללת בקטריוצינים הנמנים עם קבוצת פפטידים המכונים lantibiotics [16]. בקבוצה השניה, שהיא גדולה בהרבה מקודמתה, נכללים שאר הבקטריוצינים הידועים [5, 6].

בקטריוצינים מקבוצת ה-lantibiotics

ה-lantibiotics וביניהם אלה המיוצרים ע"י חיידקי חומצת חלב, הם פפטידים בעלי מיטען חשמלי חיובי ומשקל מולקולתי נמוך (בד"כ קטן מ-4,000 דלטון) העוברים "עיבוד" לאחר תרגום ה-mRNA (post transcriptional modification). שלבי "עיבוד" אלה כוללים: חיתוך אנזימי של קטע פוליפפטידי קצר מהקצה האמינו סופני המכונה leader sequence ומודיפיקציה כימית של החומצות האמיניות סרין וטראונין ע"י דהידרציה של מולקולת מים תוך קבלת שיירים של dehydroalanine ו-dehydrobutirine, בהתאמה [14]. שיירים אלה מגיבים עם הקבוצות הסולפהדריליות של שיירי חומצה אמינית ציסטאין ברצף הפפטידי, תוך קבלת טבעות תיאואתריות (-S-) משני טיפוסים: lantionine ו-beta-methyllantionine [16]. בסיום שלבי "עיבוד" אלה, מתקבל פפטיד "בשל" (mature) הניחן בפעילות בקטריצידית. יצויין, כי nisin אשר היה הבקטריוצין הראשון שהתגלה הוא גם "אב הטיפוס" של כל קבוצת ה-lantibiotics [15].

בקטריוצינים שאינם lantibiotics

בקבוצת הבקטריוצינים הזו כלולים בין היתר בקטריוצינים המיוצרים כפפטידים "בלתי מעובדים", העוברים בשלב מאוחר חיתוך של רצף פוליפפטידי מהקצה האמינו-סופני. מרבית הבקטריויצינים הידועים שאינם lantibiotics הם פפטידים בעלי משקל מולקולתי הנמוך מ-10 ק"ד ורק מיעוטם ניחן במשקל מולקולתי העולה על עשרות אלפי דלטון [6]. מבין הבקטריוצינים הנמוך-מולקולתיים קיימת תת-קבוצה הכוללת פפטידים בעלי מספר תכונות משותפות. משקל מולקולתי נמוך (7-6 ק"ד); עמידות גבוהה בפני טיפול תרמי; יציבות בטווח רחב של pH; נקודה איזואלקטרית (pI) בתחום ה-pH הבסיסי וביוסינתזה הכוללת של חיתוך leader sequence מהקצה האמינוסופני לפני קבלת הפפטיד הפעיל [16].

חקר מנגנון הפעולה של בקטריוצינים של חיידקי חומצת חלב

ללא ספק המחקר המעמיק והנרחב ביותר בהיקפו בתחום לימוד מנגנון הפעולה של הבקטריוצינים, המיוצרים ע"י חידקי חומצת חלב, נערך על הבקטריוצין nisin. מחקר זה אופיין לכל אורכו, הן בחקירת תוצאות החשיפה של חידקים רגישים ל-nisin והן בלימוד מעמיק, שמטרתו הבנת פעילותו ברמה המולקולתית.

מנגנון הפעולה של nissin

כבר בשנת 1960 דיווח Ramseier על דליפת חומרים הבולעים בתחום העל-סגול מהציטופלסמה של חידקים גראם-חיוביים שטופלו ב-nisin. לתהליך הדליפה נלווה בשלביו המאוחרים גם תמס. מתוצאות מחקריו הסיק Ramseier כי nisin פועל כדטרגנט קאטיוני הפוגע בשלימות הממברנה הציטופלסמית של התאים הרגישים. הסבר שונה לפעולת ה-nisin ניתן ע"י Linnet & Stromniger [18] ונתמך מאוחר יותר ע"י עבודתם של Reisinger וחב' [19] אשר הראו, כי nisin מסוגל לפגוע בריאקציית מפתח הקשורה בביוסינתזה של פפטידוגליקן (פולימר המהווה מרכיב עיקרי בדופן התא של חידקים גראם-חיוביים). הוכח, כי הבקטריוצין nisin יוצר מיכלול עם הקודמן MurNac (undecaprenyl-PP pentapeptide), המהווה חומר מוצא בביוסינתזה של הפפטידוגליקן ולפיכך פוגע ביכולתם של החיידקים לייצר דופן תקין [19]. בהקשר זה הראו Bierbaum & Sahl [10] הפעלת autolysins כמפרקי דופן בעיקבות חשיפה ל-nisin [20].

מסקנותיו הראשוניות של Ramseier משנת 1960 [17] קיבלו תמיכה מדעית רחבה במרוצת השנים וכיום מוסכם על החוקרים, כי הפעילות הבקטריצידית של nisin היא תוצאה ישירה של פגיעה בממברנה הציטופלסמית של תא החיידק, הגוררת אחריה שרשרת של השפעות משניות הגורמות למות התאים המטופלים [21].

Rhur & Shal [21] הראו, כי הדליפה המהירה של יוני אשלגן מתוך הציטופלסמה של התאים המטופלים ב-nisin גורמת לירידה , מהירה ב"פוטנציאל הממברנה" (דה-פולריזציה). דהפולריזציה של ממברנת תאי החיידקים גוררת אחריה פגיעה חמורה ביכולת החיידקים לקיים תהליכים מטאבוליים דורשי אנרגיה כדוגמת קליטה פעילה של חומצות אמיניות. מימצאים אלה סיפקו לראשונה עדות להיווצרותם של נקבוביות/תעליות (pores/channels) בממברנת התא של חיידקים רגישים. כמו כן התברר, כי פעילות nisin תלויה בקיום "פוטנציאל ממברנתי" וכי חידקים בעלי "פוטנציאל ממברנתי" ירוד, עמידים יותר באופן יחסי [21].

בספרות קיימים מימצאים סותרים בהיקשר להשפעה של nisin על מערכות דגם סינתטיות כדוגמת ליפוזומים. Rhur & Shal [21] ו-Kordel & Shal [22] הראו, כי nisin אינו משפיע על ליפוזומים, שהוכנו מפוספוליפידים סינתטיים (החסרים מרכיבים שהופקו מממברנות של תאים רגישים). ממימצאים אלה הסיקו הנ"ל כי לפעולת ה-nisin נדרשת אינטראקציה עם מרכיב כלשהו, המצוי בממברנות התאים, אך חסר במערכות דגם סינתטיות. חוקרים אלה אף שיערו, כי מרכיב זה עשוי להיות חלבוני באופיו [21].

בניגוד למימצאים שדווחו ע"י קבוצות המחקר המוזכרות לעיל, הודגם בעבודתם של Henning וחב' [23], כי nisin מסוגל לגרום לדליפה של מולקולות הכלואות בליפוזומים, שהוכנו מפוספוליפידים סינתטיים ולכן סתרו את הטענה בדבר הצורך במרכיב חלבוני לצורך פעולת ה-nisin [21]. בחלקה, הסתירה בדבר היכולת של nisin לפגוע בשלימות השיכבה הפוספוליפידית-ממברנתית של ליפוזומים סינתטיים עשויה לנבוע מהצורך של קיום "פוטנציאל ממברנה" לפעולת ה-nisin [21, 24]. סברה זו מתחזקת לאור העובדה ש-nisin מסוגל לפגוע בשלימות הממברנה של ליפוזומים בעלי הרכב פוספוליפידי סינתטי החסרים מרכיבים חלבוניים כלשהם, בתנאי שהושרה בהם "פוטנציאל ממברנה" מלאכותי (לדוגמה ע"י יצירת מפל פיעפוע מלאכותי של אשלגן) [24]. בניגוד לכך, ל-nisin אין השפעה כאשר אין משרים בליפוזומים אלה "פוטנציאל ממברנה" מלאכותי [25]. מעקב אחר היווצרות נקבוביות בודדות (single-channel recording) ע"י nisin במערכות דגם מסוג planar lipid bilayer הראה, כי הקוטר של הנקבוביות הנוצרות בממברנה עשוי להגיע עד ל-1 ננומטר. נקבוביות מסוג זה מאפשרות דליפה של מולקולות הידרופיליות במשקל מולקולתי של עד כ-500 דלטון [24]. הונח, כי הנקבוביות הנוצרות ע"י nisin הן תוצאה של אוליגומריזציה של מספר לא קבוע של מולקולות בודדות, המאפשרות התהוות חורים בגדלים מולקולתיים שונים [24].

להבנת הבסיס המאפשר את חדירת מולקולות ה-nisin לממברנה הציטופלסמית של חיידקים רגישים, תרמה רבות עבודתם של Henning וחב' [23]. קבוצה זו סיפקה עדויות ברורות לקיום אינטראקציות בין הפוספוליפידים הממברנתיים לבין מולקולות ה-nisin. מחקרם הצביע על כך, שאינטראקציות הידרופוביות בין השרשרות האליפאטיות של חומצות השומן בפוספוליפידים לבין מולקולות ה-nisin (המאופיינות בתכולה גבוהה של חומצות אמיניות אי-פולריות), הן הבסיס המולקולתי המקנה את יכולת ההתבססות של nisin בממברנת התא [23]. בנוסף לכך, הראתה קבוצת מחקר זו, כי להרכב הפוספוליפידים בממברנה נודעת השפעה רבה על מידת הרגישות ל-nisin. כמוו כן התברר, כי גם אינטראקציות אלקטרוסטטיות, בין הראשים הפולריים של מולקולות פוספוליפיד לבין מולקולות ה-nisin, עשויות לתרום להאצת חדירת מולקולות ה-nisin לשיכבה הפוספוליפידית-ממברנתית בליפוזומים [22, 26]. עבודתם של Henning וחב' [23] סיפקה ראיות מוצקות לכך, שהפסקת תהליכי ביוסינתזה בחיידקים כדוגמת סינתזה של חלבונים, פפטידוגליקן, דנ"א ו-רנ"א אינם אלא תוצאות משניות לפעולתו הראשונית של nisin. מחקר שנערך במקביל ועסק בחקר מנגנון פעולתו של הבקטריוצין lactostrepcin 5 הצביע אף הוא על כך [27].

בנוסף להשפעה הבקטריצידית של nisin על חידקים במצב וגטאטיבי נמצא, כי ל-nisin השפעה בקטריוסטטית על נבגי חידקים גראם-חיוביים. היכולת לל nisin למנוע נביטת נבגים של מינים של Clostridium ו-Bacillus דווחה בהרחבה ונסקרה ע"י Delves-Broughton [12]. מתברר, כי ההשפעה של nisin על נבגים היא תוצאה של הפרעה הנגרמת בשלב של תפיחת הנבגים. על סמך הכרת המיבנה הכימי של מולקולת ה-nisin, הניחו Morris וחב' [28], כי חומצות אמיניות dehydroalanine ו-dehydrobutyrine המצויות ב-nisin, מגיבות באופן קוולנטי עם קבוצות סולפהידריליות (-SH) בחלבוני הממברנה ופוגעות ע"י כך בנביטה תקינה. תמיכה במנגנון זה ניתנה מאוחר יותר בעבודתם של Liu & Hansen [29].

השפעת הבקטריוצינים של הכוח הפרוטון - אלקטרומניע

אחד הביטויים האופיניים ביותר לתיפקוד התקין של ממברנת התא בחידקים הוא היכולת לקיים תופעה פיזיולוגית הידועה בשם "כח-פרוטון-אלקטרומניע" (pmf) [30]. פגיעה ב-pmf מהווה אמצעי מעקב אחר פעילות חומרים הפגועים בשלימות הממברנה ובמיוחד כאלה המסוגלים ליצור בה נקבוביות. כך לדוגמה, ionophores כמו valinomycin ו-nigericin ידועים בכושרם לגרום לפגיעה ב-pmf [31].

מסתבר, כי nisin פוגע בשני הרכיבים של ה-pmf, דהיינו, גורם לדה-פולריזציה של ממברנת התא, תוך שבירה בו-זמנית של מפל ה-pH המתקיים דרכה [26, 32, 33, 47]. השפעות דומות על רכיבי ה-pmf הוכחו גם עבור בקטריוצינים אחרים כדוגמת pediocin JD [34], pediocin PA-1, lactacin F, ו-leuconocin על ה-pmf [35]. המיוצרים ע"י חידקים מהסוג Lactobacillus, Pediococcus, ו-Lactococcus, בהתאמה.

מעורבות דופן התא של חיידקים בחסינות לבטקריוצינים

דופן התא של חידקים גראם-חיוביים וגראם-שליליים מהווה חזית ראשונה הבאה במגע עם מוליקולות הבקטריוצינים. כבר ב1960- דיווח Ramsier [17] על ספיחה של nisin לתאים מטופלים. מבדיקת היכולת של חיידקים גראם-חיוביים לספוח בקטריוצינים שונים מתברר, כי קיימים בקטריוצינים כדוגמת lactocin 27 [36] ו-pediocin AcH [37] הניחנים ביכולת להיספח לחיידקים מזנים רגישים ומזנים חסינים גם יחד. לעומתם, בקטריוצין plantaricin SIK 83 נספח באופן ייחודי רק לחיידקים מזנים רגישים [38]. על אף האמור לעיל המשותף לבקטריוצינים המוזכרים לעיל הוא העדר היכולת להיספח לחיידקים גראם-שליליים. מחקר מקיף בתחום הספיחה של הבקטריוצינים לחיידקים נעשה לגבי הבטקריוצין pediocin AcH המיוצר ע"י P. acidilactici [37]. מתברר, כי ספיחת pediocin AcH לדופן התא תלויה ב-pH, יורדת בנוכחות אניונים ויוצאת אל הפועל דרך ספיחה לחומצות ליפוטיכואיות (מהוות מרכיב חשוב בשיכבת הפפטידוגליקן בדופן התא של חיידקים גראם-חיוביים) [37]. חשוב לציין, כי ע"י פירוק אנזימי של דופן התא של חיידקים גראם-חיוביים והפיכתם לפרוטופלסטים ניתן להפוך חיידקים חסינים לרגישים, כפי שדווח עבור lactacin F [39] ועבור pediocin SJ-1 [40].

החסינות של חיידקים גראם-שליליים כדוגמת E. coli ו-S. typhimurium לבקטריוצינים מיוחסת בד"כ ליהיעדר יכולתם לחדור מבעד לדופן התא הייחודי שלהם עד לממברנה הציטופלסמטית. להבדיל מדופן התא של חיידקים גראם-חיוביים (המורכב משיכבה עבה של פפטידוגליקן), הדופן של חיידקים גראם-שליליים מכיל רק שיכבה דקה של פפטידוגליקן, אך מחוצה לה מצויה ממברנה ייחודית הקרויה outer membrane (להלן תסומן כ-OM) [41, 42]. OM פועלת כמחסום הקובע את כושר החדירות של חומרים כדוגמת אנטיביוטיקה וחלבונים לתוך התא (בעיקר על בסיס תכונות ההידרופוביות וגודל מולקולתי) [41]. הבסיס המולקולתי ליכולת ה-OM למנוע חדירת חומרים דרכה, טמון בעיקרו בסידור המרחבי של מולקולות בשם lipopolysaccharides, המהוות מרכיב עיקרי בה (להלן יסומנו כ-LPS). מולקולות ה-LPS פונות לסביבה החיצונית של תא החיידק, ומיוצבות באמצעות גישור של קאטיוני מתכות דו-ערכיים (בעיקר ע"י Mg⁺⁺ ו-Ca⁺⁺) [41, 42]. הכרת המיבנה והתכונות של ה-OM כמחסום טיבעי בחידקים גראם-שליליים, מהווה בסיס לשימוש בשיטות פיזיקליות וכימיות, שמטרתן להגביראת החדירות דרך ה-OM [43, 44]. בשיטות אלו נכללים טיפולים פיזיקליים (כדוגמת חשיפה למחזורי הקפאה-הפשרה ו"עקת חום") וטיפולים כימיים המתבססים על ספיחה (chealation) או הדחקה (displacement) של קאטיוני Mg⁺⁺ ו-Ca⁺⁺ [14, 46]. הראשונים שהראו כי ע"י "עקיפת" מחסום ה-OM ניתן להפוך חיידקים גראם-שליליים לרגישים היו Kordel & Sahl [22]. קבוצה זו דיווחה, כי בעיקבות חשיפת חיידקי E. coli ל"עקה אוסמוטית" בנוכחות הסופח EDTA הוגברה חדירות ה-OM לבקטריוצין nisin. במקביל לקבוצה זו הראה Anderson [38], כי חשיפת ספרופלסטים שהוכנו מחידקי E. coli החסינים באופן טיבעי לבקטריוצין plantaricin SIK-83, גרמה לתמס מהיר. מימצאים אלה תמכו בתוצאות המחקר של Kordel & Sahl [22] וחיזקו את הסברה, שבהתייחס לבקטריוצינים האלה, מהווה ה-OM מחסום בלתי חדיר המונע את מעברם עד לממברנת התא. עבודות אלה שימשו בסיס לעבודות נוספות, בהן חיידקים גראם-שליליים פתוגנים כדוגמת זנים של חיידקי S. typhimurium 1 ו-E. coli הומתו ע"י nisin בנוכחות EDTA כסופח [45].

לסיכום, הבקטריוצינים המיוצרים במהלך הגידול של אוכלוסיות מסויימות של חיידקי חומצת חלב והפוטנציאל הטמון בהם כחומר שימור ביולוגי, הפכו בעשור האחרון למוקד התעניינות מרכזי בתחום מיקרוביולוגיית המזון. יכולתם של חלק מהבקטריוצינים לקטול חיידקים פתוגניים המעורבים בהרעלוות מזון מהווה תמריץ להעמקת המחקר הטומן בחובו השלכות על בריאות הציבור. יש לקוות, שהרחבת המחקר תוביל בעתיד הלא רחוק להרחבת השימוש בחומרים טיבעיים אלה.

ביבליוגרפיה

1. Hardy KG, In: Experimental Microbial Ecology, Eds. Burns RG & Slater JH, Publisher Blackwell Scientific Publications, 1982, 368-378.
   
   
2. Konisky J, Colicins and other bacteriocins with established mode of action. Ann Rev Microbiol, 1982; 36: 125-144.
   
   
3. Tagg JR, Dajani AS & Wannamaker LW, Bacteriocins of Gram-positive bacteria. Bacteriol Rev, 1976; 40: 722-756.
   
   
4. Klaemhammer TR, Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria. FEMS Microbiol Rev, 1993; 12: 39-86.
   
   
5. Klaemhammer TR, Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochimie, 1988; 70: 337-349.
   
   
6. Nettles CG & Barefoot SF, Biochemical and genetic characteristics of bacteriocins of food-associated lactic acid bacteria. J Food Prot, 1993; 56: 338-356.
   
   
7. Smith JL & Palumbo SA, Use of starter cultures in meats, J Food Prot, 1981; 44: 936-955.
   
   
8. Smith JL & Palumbo SA, Use of starter cultures in meats. J Food prot, 1983; 46: 997-1006.
   
   
9. Daeschel MA, Antimicrobial substances from lactic acid bacteria for use of food preservatives. Food Technol, 1988; 43: 164-167.
   
   
10. Hurst A, Nisin. Adv Appl Microbiol, 1981; 27: 85-123.
    
    
11. FDA, Nisin preparation: Affirmation of GRAS status as a direct human food ingredient. Food and Drug Administration, Federal Register, 1988; 53: 11247.
    
    
12. Delves-Broughthon J, Nisin and its uses as a food preservative. Food Technol, 1990; 44: 100-117.
    
    
13. Harris LJ, Fleming HP & Klaenhammer TR, Developments in nisin research. Food Res Int, 1992; 25: 56-66.
    
    
14. Hansen JN, Antibiotics synthesized by posttranslational modification. Ann Rev Microbiol, 1993; 47: 535-564.
    
    
15. Gross E & Morell JL, The structure of nisin. J Am Chem Soc, 1971: 93: 4634-4635.
    
    
16. Kok J, Holo H, van-Belkum MJ & al, In: Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria, Hoover D & Steenson L (ed). Publisher Academic Press, 1933, 121-150.
    
    
17. Ramseier HR, Die Wirkung von Nisin auf Clostridium butyricum. Prazin Arch Microbiol, 1960; 37: 57-94.
    
    
18. Linnett PE & Stromniger JL, Additional antibiotic inhibitors of peptidoglycan synthesis. Antimicrob Agents Chemother, 1973; 4: 231-236.
    
    
19. Reisinger P, Seidel H, Tschesche H & Hammes WP, The effect of nisin on murcin synthesis. Arch Microbiol, 1980; 127: 187-193.
    
    
20. Bierbaum G & Sahl HG, Autolytic system of Staphylococcus simulans 22: influence of cationic peptides on activity of N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase. J Bacteriol, 1987; 169: 5452-5458.
    
    
21. Ruhr E & Sahl HG, Mode of action of the peptide antibiotic nisin and influence of the membrane potential of whole cells and on cytoplasmic and artificial membrane vesicles. Antimicrob Agents Chemother, 1985; 27: 841-845.
    
    
22. Kordel M & Sahl HG, Susceptibility of bacterial, eukaryotic and artificial membranes to the distruptive action of the cationic peptides Pep 5 and nisin. FEMS Microbiol Lett, 1986; 34: 139-144.
    
    
23. Henning S, Metz R & Hammes WP, Studies on the mode of action of nisin. Int J Food Microbiol, 1986; 3: 121-134.
    
    
24. Sahl HG, Kordel M & Benz R, Voltage-dependent depolarization of bacterial membranes and artificial lipid bilayers by the peptide antibiotic nisin. Arch Microbiol, 1987; 149: 120-124.
    
    
25. Kordel M, Schuller F & Sahl HG, Interaction of the pore-forming peptide antibiotics Pep ,5 nisin and subtilin with non-energized liposomes. FEBS Lett, 1989; 244: 99-102.
    
    
26. Gao FH, Abee T & Konings WN, Mechanism of action of the peptide antibiotic nisin in liposomes and cytochrome C oxidase-containing proteoliposomes. Appl Environ Microbiol, 1991; 57: 2164-2170.
    
    
27. Zajdel JA, Ceglowski P & Dobrzanski WT, Mechanism of action of lactostrepcin ,5 a bacteriocin produced by Streptococcus cremoris .202 Appl Environ Microbil, 1985; 49: 969-974.
    
    
28. Morris SL, Walsh RC & Hansen JN, Indentiffication and characterization of some bacterial membrane sulfhydryl groups which are targets of bacteriostatic and antibiotic action. J Biol Chem, 1984; 259: 13590-13594.
    
    
29. Liu W & Hansen JN, Some chemical and physical properties of nisin, a small protein antibiotic produced by Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol, 1990; 56: 2551-2558.
    
    
30. Mitchell P, Keillins respiratory chain concept and its chemiosmotic consequences: the evolution of the chemiosmotic principle. Science, 1979; 206: 1148-1159.
    
    
31. Harold FM, In: The Vital Force: a Study of Bioenergetics, Publisher Freeman WH & Co. 1986.