שימוש בספורות מיקרוביאליות לביוטכנולוגיה

תקציר של Use of Microbial Spores as a Biocatalist

העמידות של ספורות מיקרוביאליות לתנאים קיצוניים דוגמת טמפרטורה גבוהה, לחץ אוסמוטי ומכני, קרינה וחומרים רעילים, היא גבוהה הרבה יותר מהעמידות של תאים מתחלקים רגילים. יחד עם זאת תכולת החלבונים, הממברנות וחומצות הגרעין של הספורות אינה נבדלת באופן מהותי מזו של תאים רגילים. מספר תיאוריות הוצעו להסביר את העמידות הגדולה של הספורות לתנאי הסביבה אך רוב ההסברים נשענו על ההרכב הכימי של הספורות והמבנה שלהן על פי מיקרוסקופיה אלקטרונית וההסברים הם במידה רבה ספקולטיביים ולא מספקים.

מחקרים ביוכימיים וגנטיים שנערכו לאחרונה על שמרים וחיידקים, הרחיבו במידה ניכרת את ההבנה לגבי התפקיד והמבנה של הספורות, ובמיוחד מחקרים העוסקים בביטוי גנים לספורולציה. למרות התפתחויות אלה, אין בהם עדיין לתת הסבר לתופעות כגון תרדמת תאים והתעוררות ספורות או גם מנגנוני עמידות של הספורות.

אין גם בנמצא מחקרים המתייחסים לשימוש בספורות של שמרים וחיידקים כביוקטליזטורים. למרות האמונה הרווחת שהספורות הינן במצב של תרדמה ופעילות מטבולית נמוכה, הסתבר מהממצאים במחקר זה שהספורות מכילות את כמעט כל האנזימים הקיימים גם בתאים רגילים ואף ברמות פעילות דומות.

צירוף עובדות אלה, של ספורות העמידות לתנאי סביבה קיצוניים, עם קשיחות מיבנית של הספורות והעובדה שהן מכילות אנזימים פעילים, מוביל למסקנה שספורות מיקרוביאליות יכולות לשמש כביוקטליזטורים מבטיחים.

תאים רגילים המשמשים כביוקטליזטורים מקובעים בדרך כלל למצע לא מסיס בביוראקטור על מנת להשאירם בתא המערכת. במצב של פעילות רציפה, התאים עשויים לעבור המסה (ליזיס) וכן האנזימים המיוצרים על ידם עשויים להיות חשופים לכימיקלים רעילים. אנזימים דגרדטיביים וגורמים נוספים לאינאקטיבציה של האנזימים. אם לעומת זאת האנזימים יישמרו בתוך התאים, האנזימים יהיו מוגנים יותר מהשפעות הסביבה והסלקטיביות של התאים יחד עם המידור של האנזימים מהסביבה יתרמו ליציבות מוגברת שלהם. זה הרעיון העומד מאחורי השימוש בספורות לביוטכנולוגיה ושעשוי להאריך במידה ניכרת את זמן השימוש בביוראקטורים.

השלב הראשון במחקר זה היה לימוד אופן הכנת הספורות של החיידק Bacilus subtillis והשמר Saccharomyces cerevisiae. שלב זה כלל את צורת הגידול של המיקרואורגניזם ושיטת האינדוקציה האופטימליים לקבלת ספורות ביעילות גבוהה (ככלל, הרעבה של התאים מעודדת יצירת ספורות, אך יש אמצעים שונים לזרז ולייעל את התהליך). בידוד הספורות של חיידק הבצילוס דרש הרתחה של התרבית לצורך הפרדת הספורות מהספורנגיות. לעומת זאת בבידוד ספורות של שמרים משקי הפרי (Asci), דרש הרחפה בתמיסה המכילה אנזימים ליטיים (Zymolyase).

הפעילויות האנזימטיות של הספורות מבצילוס נבדקו על מיצוי ספורות שנכתשו על ידי כדורי זכוכית ובהשוואה לפעילויות האנזימטיות של תאים רגילים. מלבד אנזים אחד, כל שאר 23 האנזימים שנבדקו הכילו את אותן פעילויות אנזימטיות לשני סוגי התאים, גם אם בחלקן ברמות נמוכות יותר עבור הספורות.

בשמרים כל הפעילויות האנזימטיות שנבדקו (74 פעילויות אנזימטיות שונות) התקיימו בשני סוגי התאים. אנזימים של תהליכי הגליקוליזה ומעגל החומצה הציטרית ואנזימים נוספים הראו פעילויות גבוהות יותר בספורות מאשר בתאים המתחלקים.

על מנת להפעיל את הספורות כביוקטליזטורים יש צורך לסלק את המחסום הממברנלי, כך שחומרים שונים, ובמיוחד אסטרים מזורחנים ותרכובות אורגניות במשקל מולקולרי גבוה, יוכלו לחדור לספורות ולבוא במגע עם האנזימים. לצורך זה הספורות טופלו בשיטות (ראה טבלה 1) פיזיקליות (סוניקציה, זרמים חשמליים) ושיטות ביוכימיות (ממיסים אורגניים, דטרגנטים ואנזימים ליטיים).

השינוי בחדירות של הספורות לסובסטרטים נמדד על ידי שני אנזימים מייצגים ATPase (5-triphosphatase) והאנזים ALPase (Alkline phosphatase). שלמות המבנה האולטראסטרוקטורלי של הספורות והחיוניות שלהן נמדדו במקביל לטיפולים השונים.

הדטרגנט CTAB נמצא כמתאים ביותר לשיפור החדירות של ספורות מבצילוס בעוד שהסוניקציה נבחרה כטיפול המועדף בספורות של השמר.

מהמחקר עולה שספורות מיקרוביאליות מתאימות לשמש כביוקטליזטורים וזאת על פי 3 מדדים:

1. הספורות, ובמיוחד אלו של השמר, הן בעלות מבנה חזק ועמיד.
2. כמעט כל הפעילויות האנזימטיות בתאים רגילים קיימות גם בספורות.
3. ניתן לטפל בספורות באמצעים פיזיקליים וכימיים שונים על מנת להפוך אותן חדירות לסובסטרטים.

מאחר וביישומים ביוטכנולוגיים מקובל ורצוי לעבוד עם תאים מקובעים כדי להפריד את מקור הפעילות הביולוגית מהתוצרים, נבדקה האפשרות לעבודה עם ספורות שמרים מקובעות.

תאי השמרים גודלו למשך 3 ימים במצע לספורולציה והתאים נקראו תאים מורעבים, להבדילם מתאים רגילים. תאים אלו שימשו לביקורת לפעילות האנזימטית של הספורות. הפעילות של ALPase בספורות הייתה גדולה פי 3 מהפעילות של האנזים בתאים רגילים ופי 1.3 מתאים מורעבים. תאים מורעבים וספורות קובעו בג'ל פוליאקרילאמיד. הג'ל נחתך לגרנולות קטנות. יחס הספורות לג'ל היה 0.26 gr/ml.

תאים מורעבים שקובעו בג'ל פוליאקרילאמיד הראו ירידה חדה בפעילות של ALPase בעוד שספורות מקובעות לג'ל כמעט ולא איבדו פעילות של אנזים זה. לעומת זאת, החדירות של סובסטרטים לתאים המורעבים הייתה טובה יותר מזו של הספורות. לאחר שהספורות המקובעות טופלו ב-CTAB, הייתה עלייה משמעותית בפעילות ה-ALPase בספורות, אך לא בתאים המורעבים המקובעים (ראה איור 1).

ספורות מקובעות של שמרים גילו עמידות גבוהה לטיפול בחום (90% מהפעילות של ALPase נשמרה לאחר טיפול של 20 דקות ב-60°C לעומת 50°C פעילות של האנזים בטיפול זהה בתאים מורעבים). הספורות המקובעות גילו גם עמידות גבוהה לתנאי pH קיצוניים.

ניתן היה לחזור ולקבל את הפעילות האנזימטית שנמדדה בספורות מקובעות ללא ירידה בפעילות לעומת תאים מורעבים שאיבדו את פעילותם בהדרגה.

ספורות מקובעות נארזו בקולונה (2.5ml) ליישום של ייצור המשכי של תוצרים שונים. התוצרים התקבלו ברמה אחידה ובאופן המשכי על משך זמן של 10 ימים לפחות.

ברור שנדרשים מחקרים נוספים לצורך ביסוס התוצאות והיישומים המתוארים. המחקר צריך לפנות להעמקת הידע הבסיסי של תהליכי הספורולציה, היחס בין מבנה לחדירות והעמידות הגבוהה של הספורות לתנאי הסביבה. במקביל יש צורך להכיר תכונות של ספורות ממקורות שונים. יחד עם זאת, הוכחה העליונות הביוטכנולוגית של הספורות על תאים מתחלקים כמקור לפעילות אנזימטית בביוראקטורים.